Juan M. Rodrigo, Diego C. Zappacosta, Ana C. Ochogavía, Silvina C. Pessino, José R. Romero, Ingrid Garbus, Viviana C. Echenique*

En pasto llorón (Eragrostiscurvula) ante situaciones de estrés, un aumento en la expresión de la apomixis es concurrente con modificaciones genéticas y epigenéticas, involucrando elementos transponibles.

Introducción
La apomixis en plantas se refiere a la reproducción clonal a través de semillas, que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Son pocos los genotipos apomícticos que excluyen totalmente la reproducción sexual, a estos individuos se los denomina "apomícticos facultativos", porque son capaces de producir semillas a través de ambos medios reproductivos. La línea entre la apomixis y la reproducción sexual no es del todo clara, por lo que se consideró que el carácter podría haber surgido de la desregulación de la sexualidad en lugar de ser un carácter evolutivo completamente nuevo.

Dada la relación que existe entre las vías moleculares asociadas a la sexualidad y apomixis, se han propuesto diferentes modelos para explicar, a este nivel, la ocurrencia de este peculiar modo reproductivo. Estos involucran mecanismos genéticos y epigenéticos. La presencia de un componente epigenético en el control de la apomixis se desprende del hecho de que la variación en las tasas de reproducción apomíctica varían en respuesta a influencias ambientales diversas.

Con el objetivo de dilucidar las vías moleculares involucradas en la expresión de la apomixis utilizando como modelo el pasto llorón, el Lab. De Biotecnología del CERZOS ha encarado diferentes estudios que involucran secuenciación del transcriptoma floral, estudios de expresión diferencial utilizando distintas estrategias y, más recientemente, secuenciación del genoma.

Estos estudios comenzaron en el año 2003 cuando se construyó una serie euploide de plantas que presenta diferentes niveles de ploidía y modos reproductivos (T 4x - D 2x - C 4x), pero que comparten un fondo genético común (Fig. 1). Para construir la serie se generó, a partir de una planta tetraploideapomíctica (T) una planta diploide totalmente sexual (D) utilizando cultivo in vitro de inflorescencias. Las semillas de D fueron tratadas con colchicina (que induce la duplicación cromosómica) obteniendo un individuo tetraploidecolchiploide (C). Este genotipo C inicialmente (2003) produjo progenie variable catalogándola como altamente sexual aunque no se descartó la posibilidad de un bajo nivel de expresión de la apomixis. Cuatro años más tarde (2007), se volvió a analizar el modo reproductivo de C y, sorprendentemente, la planta exhibió una alta proporción de eventos apomícticos (alrededor de 85-90%). Basándose en estos resultados se propuso que la expresión temporal de altos niveles de reproducción sexual observada en el genotipo C se podría deber al estrés genómico causado por el cultivo in vitro y la duplicación cromosómica.

Figura 1. Representación esquemática de la generación de la serie euploide.

Para comprender estos sucesos se decidió re-analizar los niveles de apomixis en la planta C y caracterizar el alcance y la naturaleza de los cambios genéticos y epigenéticos que ocurrieron durante el período 2003-2007, cuando se produjo el cambio en la expresión de la apomixis y luego, durante el período 2007-2013 donde el modo reproductivo se mantuvo estable.


Resultados

Análisis de modo reproductivo
En 2009 se realizó un nuevo análisis citoembriológico en la planta C. Este estudio mostró que esta planta poseía un nivel de sexualidad del 10% es decir que, la tasa de apomixis en la planta colchiploide C pasó de cerca de 0% en 2003 a 85-90% en 2007, y se mantuvo en valores similares en 2009 (89,7%).

Estructura genética y epigenética de las plantas T y C
A fin de buscar posibles causas de estos cambios se analizó la estructura genética con marcadores AFLP (que detectan polimorfismos en el largo de la amplificación de los fragmentos) y el nivel de metilación con marcadores MSAP (sensibles a metilaciones de citosinas) de la planta C en 2003 y 2007, periodo en que cambio la tasa de apomixis. Como control se utilizaron plantas del cv. Tanganyika (T) del cual deriva la serie de plantas. Las comparaciones se realizaron entre las plantas para el mismo año y entre años para las mismas plantas. Además, se realizó un nuevo análisis MSAP de ambas plantas durante los años 2007, 2011 y 2013.
En el estudio con marcadores AFLP para las plantas T y C en los años 2003 y 2007 se analizaron un total de 135 marcadores (74% monomórficos y 26% polimórficos). Para examinar la evolución del genoma de (T y C) cada planta en particular durante el período considerado, los perfiles genéticos fueron analizados individualmente para cada planta (Tabla 1). El total de variaciones en el tiempo fue similar entre las plantas (15-17%), con una tendencia mayor hacia la aparición de bandas en el tiempo que a la desaparición.

Con la información de estas bandas se realizó un análisis de similitud entre las dos plantas (T y C) y una misma planta en el tiempo (2003 – 2007). Los resultados mostraron mayor similitud en el 2003 (90%) en comparación con 2007 (83%) (Fig. 2a). Esta observación indica que las plantas divergieron durante este período de cuatro años, en su mayoría, de forma independiente. Este análisis de agrupamiento también mostró que T y C divergieron de manera similar a partir de sus estructuras genéticas originales (81% vs. 83% de similitud).

Tabla 1. Variación en los perfiles de  AFLP en cada planta (T y C) en el periodo 2003-2007.

Perfil Planta T Planta C
Ausencia de cambios en el tiempo 104 83% 107 85%
Presencia de cambios en el tiempo 22 17% 19 15%
Bandastotales 126 100% 126 100%

Los mismos genotipos fueron sometidos a análisis con marcadores MSAP, que muestran variaciones en la metilación de citosinas. En la primera comparación (2003-2007), se obtuvo un total de 266 marcadores epigenéticos. De estos, 201 (76%) resultaron invariables (monomórficos) y 65 (24%) fueron variables en el tiempo (polimórficos). Los polimorfismos observados en este periodo se analizaron individualmente en las plantas T y C (Tabla 2). En la planta T, las bandas polimórficas correspondientes a desmetilaciones fueron tan frecuentes como los correspondientes a metilaciones (8% contra 7%). En la planta C, por el contrario, las bandas polimórficas variables en el tiempo correspondían principalmente a metilaciones (15% contra 5%). Además, este estudio mostró que la tasa de metilaciones observada en C fue mayor que la observada en T (15% contra 7%).

Tabla 2. Variación en los perfiles de  MSAP en cada planta (T y C) en el periodo 2003-2007.

Perfil T C
Ausencia de cambios en el tiempo 227 85% 213 80%
Metilaciones ocurridas en el tiempo 18 7% 39 15%
Desmetilaciones ocurridas en el tiempo 21 8% 14 5%
Bandastotales 266 100% 266 100%

El análisis de agrupamientos de los perfiles MSAP mostró que después del período de cuatro años, las plantas sufrieron cambios en la metilación de citosinas que las hicieron epigenéticamente más similares (Fig. 2b). Ambas plantas mostraron patrones de metilación con una similitud del 58% con respecto al patrón observado en 2003. Sin embargo, la similitud entre las plantas aumentó de 71% a 82%. Estas observaciones indican que los patrones de metilación de citosina en ambas plantas cambiaron con el tiempo, con una tendencia a adquirir la misma estructura epigenética al menos en algunos loci.

Una nueva comparación entre las plantas a este nivel se realizó entre los años 2007-2011 y 2011-2013. Con estos datos se construyó una nueva matriz de similitud (Fig 2c.), que mostró que el nivel de variación entre las plantas a lo largo de los años fue menor que antes (2003 - 2007). Al parecer, con el tiempo ambas plantas tienden a estabilizar sus epigenomas y llegan a un estado de metilación similar.

Para completar el análisis se realizó un ensayo con marcadores MSAP de tres individuos del cv. Tanganyika en las mismas condiciones ambientales y éstas no mostraron cambios detectables en sus perfiles epigenéticos.

Figura 2. Dendrogramas de marcadores genéticos y epigenéticos en los genotipos T y C. Dendrogramas obtenidos con marcadores AFLP (A) y MSAPs (B) de los genotipos Tanganyika (T) y colchiploide (C) de las muestras recogidas en 2003 y 2007 y MSAPs (C) de los genotipos Tanganyika (T) y colchiploide (C) de las muestras recogidas en 2007, 2011 y 2013.

Clonación y secuenciación de bandas polimórficas
Algunas de las bandas polimórficas obtenidos con AFLP o MSAP fueron clonadas y secuenciadas y se compararon con las secuencias depositadas en las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) como base de datos general y del MunichInformation Center for Protein Sequences (MIPS) para elementos móviles. La mayor parte de las secuencias de AFLP mostraron similitud con genes codificantes de proteínas, pero no se encontraron similitudes significativas para las secuencias de AFLP en la búsqueda contra la base de datos MIPS. Por el contrario, casi la mitad de las secuencias de MSAP mostraron similitud con retrotransposones del tipo Gypsy o Copia. Basándose en estos resultados, se puede concluir que algunas de las variaciones detectadas usando marcadores MSAP ocurrieron en regiones genómicas que muestran similitud con elementos móviles.

Figura
3. Gineceo y androceo de E. curvula


Búsqueda de retrotransposones en bibliotecas de ADNc

Para analizar la presencia de transcriptos relacionados con retrotransposones, se examinaron bibliotecas de ADNc derivadas de T y C construidas poco después de la formación de la planta colchiploide C (2003). El porcentaje de secuencias que mostraron similitud con retrotransposones (valor E ≤ 1xe-08) nos indica que tales elementos fueron más abundantes en la planta C en ese momento. De los retrotransposones encontrados, la subfamilia Gypsy compone la clase más común y fueron especialmente abundantes en la planta C.

Conclusiones
Durante el período 2003 -2007 la tasa de reproducción asexual en la planta C (colchiploide) pasó de casi 0% a casi 90%. Esta modificación del nivel de apomixis fue acompañado por la aparición de modificaciones genéticas y epigenéticas. Sin embargo, también se detectaron polimorfismos genómicos en el mismo período en la planta apomíctica T (tetraploide natural), que no presentó ninguna variación en la tasa de la apomixis.

Además, se observó que el número de metilaciones detectadas por marcadores MSAP para este periodo fue mayor en la planta C con respecto al control. Las modificaciones epigenéticas que ocurrieron durante este intervalo fueron mayormente especificas, tendiendo a plantas con perfiles más similares. La comparación entre los años 2007, 2011 y 2013 mostró una clara tendencia a aumentar la similitud de ambas plantas en este nivel. Durante estos años las plantas aún estaban cambiando, pero eran más similares que en 2003.

La modificación de la tasa de apomixis en la planta C se produjo junto con modificaciones genéticas y epigenéticas, estas últimas resultaron en una mayor tasa de metilaciones en comparación con T (planta control). La clonación y secuenciación de fragmentos polimórficos detectó retrotransposones y secuencias codificantes. Por otra parte, la búsqueda de elementos transponibles en librerías de ADNc de la planta C y T obtenidas en el año 2003 encontró más retrotransposones en la planta C. Nuestros resultados coinciden con lo señalado por otros autores que detectaron altas tasas de expresión de retrotransposones Gypsy en genotipos tetraploides sexuales de Paspalum notatum en comparación con los genotipos apomícticos de la misma ploidía.

Nuestros resultados estarían sugiriendo que un aumento en la tasa de apomixis se produjo junto con un aumento en la metilación global del genoma.

*Juan M. Rodrigo1, Diego C. Zappacosta1,2, Ana C. Ochogavía 3, Silvina C. Pessino3, José R. Romero1, Ingrid Garbus1, Viviana C. Echenique1,2, 1investigadores del CERZOS (CONICET-UNS), 2docentes del Depto. de Agronomía de la Universidad Nacional del Sur.8000 Bahía Blanca, Argentina y 3Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario, 2000 Rosario, Argentina.

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